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關于如何檢測,描述以及評估CAR-Ts的前13個關鍵問題

2020-01-10

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回顧在我們最近的網絡研討會上,由全球科學傳播主管—Rajendra Kumari 博士解答的關于臨床前模型和評估CAR-T細胞療法的稀有細胞分析技術的關鍵問題。

1. 靶點識別和體外分析

你能鑒定出CAR-Ts的靶點嗎?

鑒定CAR-T細胞療法靶點的一般方法是識別在靶向癌細胞中特異性表達的蛋白/抗原,比如 CD19和ROR1.例如,ROR1在慢性淋巴細胞性白血病細胞上表達,但在正常的成人細胞中不表達(除了造血干細胞)。

我們在通過表達譜篩選此類蛋白方面已經做了詳盡的搜索。最近的研究集中在蛋白質構象變化上,即使這類蛋白的表達不是癌癥特異性的。這兩種方法都可以使用大規模篩選的方法來找出潛在靶點,或者使用計算法基于基因組數據識別出潛在靶點。

所以,是的,我們也可以采用計算法,但是用這種方法找到新靶點的概率比較小。我們也可以與客戶合作,通過計算法和試驗來驗證他們的潛在靶點,特別是在小鼠腫瘤模型上。

如何在體外檢測CAR-T的長期功能?

可以用T細胞殺傷實驗或者或趨化因子/細胞因子釋放試驗來評估CAT-R的功效。

2. 體內CAR-T模型和試驗

你是如何確定要注入的CAR-T數量?是取決于靶向抗原的表達水平嗎?

在體內研究中,注入的CAR-T數量取決于靶點,表達水平,CAR的親和力/效力以及持久性,這些都可以預先評估(比如體外試驗,耐受性試驗,PK試驗)。

在體內實時監測CAR-T細胞持久性的最佳方法是什么?

你可以用熒光素酶或熒光蛋白(如GFP等)標記,實時跟蹤CAR-T的持久性。

哪種模型適合CAR-NK細胞治療?

跟CAR-T類似,可以選擇那些表達相關靶點的模型。

你是否會用新鮮的或者冷凍的CAR-Ts進行多個PDX模型的篩選?

你可以使用新鮮的CAR-Ts或者冷凍的CAR-Ts,兩者都可以。相較而言,使用冷凍的CAR-Ts更方便一些,而使用新鮮的CAR-Ts需要做更多的額外協調工作。體外分析方面也需要協調。模型的數量在很大程度上取決于CAR-T的產量,可用的數量和研究地點,同時模型數量也會受到特定抗原,癌癥類型以及可用模型寬度的影響。

當評估免疫小鼠中的CAR-Ts時需要考慮哪些因素?

為了給移植細胞擴出更多空間,在注射CAR-T之前,小鼠需要用環磷酰胺處理清除淋巴或者進行低劑量輻照。

在同基因癌癥小鼠模型中,CAR-T細胞衰竭/功能障礙的最佳檢測方法是什么?

可以在體外評估PD-1、TIGIT、TIM-3等衰竭標志物,也可以檢測細胞因子/趨化因子的生成和細胞毒性。

您是否在表達人源腫瘤相關抗原的同基因細胞系上發現過免疫原性反應?

免疫原性反應隨抗原和細胞系的不同而不同。我們通過觀察小鼠的標準生長動力學和臨床體征來檢測免疫原性反應。大多數情況下表達水平很低所以沒有影響。在某些時候,會出現腫瘤生長速度會變慢或者小鼠體重減輕的情況。此外,我們已經對熒光素酶標記的同基因細胞系進行了大量的研究,很少發現有出現免疫原性反應。高水平細胞表面表達也許能增強免疫原性反應。

3. 用類器官模型評估CAR-T 細胞療法

你們是否正在開發用于CAR-T評估的類器官模型?

是的,我們與Hubrecht Organoid Technology (HUB)合作開發CAR-T 評估的類器官模型,使用他們的實驗設計(來源于Clevers實驗室)。這些模型包括來自HUB的病人來源的類器官模型(PDO),以及來自我們PDX收集的PDX來源的類器官模型(PDXO)。

PDX模型廣泛應用于CAR-T研究,但是通量有限。類器官平臺將支持更多的模型,具有多種多樣的抗原表達水平,異質性以及不同的癌癥類型,能在更高通量的384孔板上大大縮小CAR-Ts的使用量。

有報道稱,類器官模型被用于觀察CAR-T和NK治療的結直腸癌的反應(比如靶向EPCAM)。我們目前正在探索其與免疫細胞共培養的方法,但是需要優化新的技術和試驗條件來測試CAR-Ts。我們可以提供的第一個平臺是PDXO的篩選,包括提供各種各樣的癌癥類型的收集以及相匹配的體內模型。

如果體內模型不太理想的話,3D模型或者人體類器官模型是否有所幫助?

與體內模型相比,類器官模型的優勢在于可以培養出正常的人體組織,從而可以對正常的人體組織進行毒性測試,這在異種移植系統或者同基因移植系統中是不可能實現的。

4. 稀有細胞分析技術

你能利用稀有細胞分析技術來觀察CAR-T表型嗎?

是的,可以利用此項技術分析不同的表型比如CD4+和CD8+。這項技術對于像中央記憶細胞這樣的細胞來說更具有潛在優勢,與更好療效相關的效應表型相比具有更好的持久性。

你是否使用過稀有細胞分析技術來檢測CTCs?

是的,這項技術已經被用于檢測PDX模型中的CTC,實際上這是最初的目的。這個平臺后來被擴展用于臨床前和臨床檢測CAR-T,通過關聯藥效與外顯率來研究其響應/復發機制。

Topics: Blog, Oncology

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