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識別和分析T細胞受體

2019-03-05

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學習個體化T細胞治療中的T細胞受體(TCR)相關知識,包含TCR多樣性,TCR庫和TCR如何進行表征分析—包括MHC-四聚體方法。

過繼性T細胞治療和TCR

過繼性T細胞治療是一種新的治療方法,可以形成血液癌病人的長期緩解。T細胞受體(TCR)在過繼性T細胞治療(ACT)中起著重要作用。TCR可以識別腫瘤細胞,把腫瘤細胞作為抗原呈遞給細胞毒性T細胞(CTL)。

這可以通過將自然存在的T細胞賦予識別和清除靶細胞的功能或者讓自體T細胞通過改造之后表達可以與腫瘤細胞組織相容性抗原(MHC)呈遞的腫瘤相關抗原(TAA)或者腫瘤特異性抗原(TSA)具有高親和力的特異性TCR。靶向病人體內腫瘤細胞的特異性抗原可以被稱為高效的個體化癌癥治療。

本文主要通過對過繼性T細胞治療(ACT)中T細胞受體(TCR)的分析,來認識T細胞受體庫的重要性和如何進行T細胞受體表征分析。

T細胞受體多樣性

我們的免疫系統中擁有超過3千億個T細胞和超過3億種T細胞受體(TCR)。T細胞功能的發揮依賴于TCR信號。抗原誘導的TCR活化可以激活下游信號通路。這些通路的激活可以造成T細胞增殖,活化和細胞因子的產生,比如干擾素g,白介素2和顆粒酶B,所有這些對于表達特異性抗原的腫瘤細胞的殺傷都起到關鍵作用。

TCR是一種高度多樣的異二聚體,主要有α和β鏈或者γ和δ鏈構成。每一種TCR都是通過抗原識別位點對特異的抗原識別。

這樣的TCR結構主要來源于V(D)J重排— TCRα和δ鏈的可變區是由多個V(Variable)基因和J(Joining)基因重排組成,TCRβ 和 γ鏈的可變區除了多個V基因和J基因的重排之外還有多個D(Diversity)基因參與重排。

當TCR完成重排之后,α和β鏈可以與抗原呈遞細胞(APC)上的多肽組織相容性抗原(pMHC)結合。

TCR庫在有效殺死腫瘤細胞中的重要性

TCR庫被定義為在單一個體體內所有T細胞表達的TCR。TCR庫是動態的,并且在癌癥,自身免疫性疾病,炎癥和感染等的發生和發展中會有很大變化。

在腫瘤中,CTL可以通過識別TAA和TSA有效殺死腫瘤細胞。通過對腫瘤浸潤淋巴細胞庫的分析,可以將這些參與特異有效的殺死腫瘤細胞的細胞群鑒別出來。

主要挑戰在于如何在大量的免疫細胞中富集這些細胞并分析其多樣性。

TCR表征和TCR庫分析

目前的免疫治療生物制劑只能對少于30%的病人有效。在這些對免疫檢查點抑制劑有效的病人中,一致的地方在于這些病人擁有更廣泛的和更多擴增的腫瘤特異性T細胞克隆。所以,目前的研究熱點和挑戰就是在于學習對于免疫治療有療效的病人和沒有療效的病人的T細胞庫。

為什么TCR表征分析如此重要?

T細胞的特異性是通過每個T細胞的特異性的TCR介導的。每個個體都存在很大多樣性的識別和清除特異性抗原的TCR。通過對組織樣本的T細胞多樣性的測量,可以對跟蹤病人對腫瘤特異性抗原的反應提供有用信息,從而得到有效治療。

對于免疫治療和T細胞治療,追蹤不同時間段的在病人不同組織中的針對腫瘤特異性抗原的T細胞的反應性很關鍵。

目前分析TCR庫有多種方法存在,但是還沒有一種方法是標準方法或最好的方法。具體使用哪種方法取決于個人傾向,具體目的和可提供的技術。

測序方式是最早被采用并且目前被廣泛使用的技術之一,因為這項技術易于和研究機構建立基于DNA/RNA樣本的外包服務。然而,還有一些其他新的技術。

使用基于5’RACE(cDNA末端快速擴增)的下一代測序進行TCR分析

有一些商業公司提供了TCR分析服務(比如SMART?),使用基因組DNA或RNA作為分析原料。這項服務可以進行大規模分析或者可以在單次實驗中分析單個細胞的數百萬個TCR。

雖然這項技術可以產生高通量的數據,但需要加入大量的核酸(每對引物需要50-100ng),成本較高。另外一個挑戰在于基于預測的抗原特異性整合不同組的TCR序列。

在TCR分析中使用MHC四聚體技術的優勢

只有當抗原多肽結合在細胞表面的組織相容性復合物(pMHC)相應凹槽時,TCR才會進行識別。TCR-pMHC相互作用可以指導T細胞選擇性擴增,然后成熟為具有功能的T細胞。

由于pMHC單體和TCR的結合力較低,pMHC四聚物技術得以發展,四聚物對TCR的結合力是單體的100倍。這就提供了一項深入學習TCR庫的技術。pMHC四聚體是由四個分別結合有特異性抗原多肽和相應熒光基團標記的MHC單體構成。

熒光素標記的MHC多肽四聚體

現在有很多熒光素標記的pMHC四聚體可供選擇。這就允許了單細胞表型分析,使得利用最多可達17色通道的流式細胞儀同時分析不同T細胞亞群成為可能。

這項技術可以通過流式細胞分選,獲得目標T細胞群,還可以繼續進行細胞培養或下游分析。而之前所述的測序技術則無法再進行下游進一步的樣本分析。

目前使用熒光素標記的pMHC四聚體的限制是為了選擇合適的四聚體,我們需要了解哪些pMHC四聚體對哪些TCR是特異性的。

DNA標簽MHC多肽四聚體

最近的創新是把MHC四聚體標記上DNA序列的標簽。帶有DNA標簽的四聚體可以通過后續的PCR擴增和測序得到相應的特異性的四聚體信息。

這項技術可以對腫瘤特異性的CD8+ T細胞進行鑒定,分離,定量和測序。DNA標簽技術可以跨越目前同時使用數百種pMHC四聚體分析T細胞庫和TCR所面臨的障礙。

另外,通過結合TCR的深度測序的技術進步使得同時對大量的T細胞進行TCR測序成為可能。所以,研究者既可以從T細胞庫中分離得到多肽特異性T細胞,也可以通過pMHC四聚體技術得到的單個T細胞進行單細胞TCR測序分析。

這樣的技術平臺可以針對大量的細胞或單個細胞進行分析。可以讓分離在腫瘤抗原刺激的CTL介導的腫瘤細胞殺傷過程中參與的特異性T細胞的鑒定變得更加簡單。

通過DNA標簽MHC四聚體鑒定單個T細胞的TCR和其多肽結合特異性
Identification of Single T Cell Populations by Barcoded pMHC Tetramers

總結

TCR分析是對免疫治療以后負責腫瘤細胞清除的特異性T細胞克隆的鑒定的關鍵。最新的MHC四聚體技術使得TCR表征分析變得更加簡單。這原本是一個很有挑戰性的工作,因為每個T細胞都有自己的獨特的TCR序列以識別不同的結合了多肽抗原的MHC。通過對TCR的表征分析,我們可以鑒定出這些T細胞靶向的特異性抗原。

MHC四聚體使得研究者們學習或辨認出對免疫治療有療效或沒有療效的病人的腫瘤特異性T細胞的不同。這項技術可以鑒定出對腫瘤清除起到關鍵作用的T細胞克隆和相應的表位(或者全新的表位)。通過這些信息,我們可以很大程度上提高下游的癌癥疫苗或者T細胞治療的設計。

Topics: Oncology

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